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IMR-90人胚肺成纖維細胞操作流程

瀏覽次數:819發布日期:2020-06-17
   操作流程:
  1、主要試劑與儀器:倒置相差顯微鏡。
  2、細胞的復蘇培養傳代及凍存:
  1)細胞的復蘇培養從液氮罐中取出凍存管,立即投入37℃水浴,并不斷的搖動,使之迅速融化。將溶解的細胞凍存管取出,用酒精消毒后打開,吸出溶有細胞的凍存液,加入事先裝好培養液(37℃預熱,8~10倍體積)離心管內,稍微吹打混勻,然后1000rpm5min,去除上清,加入適量培養液,吹打成細胞懸液,以1×105/ml密度接種于25cm2培養瓶內,在37℃、5%co2及飽和濕度下培養。
  2)細胞傳代原代培養的hek-293細胞48h換液1次,細胞長至60%~70%融合時,用0.25%胰酶消化1~2min,將培養瓶再用手掌輕輕敲打使細胞脫壁、懸浮、分散,為使細胞進一步分散可用吹打管輕輕吹打幾次,獲得細胞懸液,然后加入倍量的培養基,溫和混勻,吸管分裝混合液,傳代擴增細胞。
  3、細胞形態的觀察在倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞的生長情況及形態特征。
  4、細胞的計數常規消化細胞,待細胞變圓、脫壁并浮起,加入少量培養基離心,再用pbs重懸并吹打制成細胞懸液。在細胞計數板蓋玻片的一側加微量細胞懸液,用10×物鏡觀察計數板四角大方格細胞數,按公式計算出細胞數。細胞數/ml原液=(四方格細胞數之和/4)×104。
  5、細胞的貼壁率指數生長期的細胞,以0.25%胰酶消化成單細胞懸液,計數后分別接種于12個25cm2培養瓶中,每兩小時隨機取出3瓶細胞,吸除培養基及未貼壁細胞,加入胰消化酶消化、計數已貼壁細胞,取其平均值,按照公式:貼壁率(%)=(已貼壁細胞數/接種細胞數)×100%,計算貼壁率。
  6、生長曲線取指數生長期的細胞用胰酶消化制成單細胞懸液,以1×104/孔接種于24孔板,每孔加入1ml培養基。每天隨機取3孔,計數每孔細胞的數目并計算平均值。連續計數10d,繪制細胞生長曲線
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